Universidad
de Panamá
Facultad de Ciencias Naturales,
Tecnología Y Exactas
Escuela Biología
Pruebas antagónicas realizadas con hongos endófitos extraídos de la planta Zamia ipetienses contra dos bacterias, Klebsiella y Proteus.
Romaña, S; Benítez, J.; Gordón, A.; Polanco S.; Montañez, D.
I Semestre 2013
Resumen
Las pruebas de antagonismo
fúngico son esenciales para la detección de microorganismos con potencial para
el desarrollo de biopesticidas o agentes de control de plagas insectiles y
patógenos vegetales. Durante este laboratorio pusimos s prueba junto con hongos
y bacterias realizar el proceso de antagonismos entre ellas. Los hongos
aislados fueron a partir de la hoja de la Zamia
ipetiensis (planta nativa de Panamá), en los cuales tuvimos la
oportunidad de obtener 21 hongos aislados de esta planta. Los hongos fueron
clasificados en plántulas adultas y plántulas jóvenes. De igual manera se distinguieron
de acuerdo a su etapa de crecimiento (rápido, medio y lento). A estos hongos se cultivaron en un medio de
Papa –Dextrosa, en la cual tuvimos total
de 9 platos de hongos cultivados; ya que a cada plato se les asigno 3
tubitos con los hongos obtenido de la Zamia.
A esto se les dio tiempo para que los hongos pudieran crecer de la forma
adecuada para luego si practicarles el método de antagonismos con bacterias
tales como la Proteus y la Klebsiella. Durante la práctica se
realizaron varias réplicas para obtener mayor resultado, sin embargo los
resultados dieron negativos; debido a que no se puedo apreciar el sistema antagónico
de la bacteria con el hongo.
Palabras
clave
Antagonismo: En biología el antagonismo es la
interacción entre organismos o sustancias que causa la pérdida de actividad de
uno de ellos, como la acción de los antibióticos frente a las bacterias.
Aislar: Evitar o disminuir la propagación de un fenómeno
físico, como el calor, el sonido o la electricidad, por medio de un material
aislante.
Bacteria: Son microorganismos unicelulares que presentan un
tamaño de unos pocos micrómetros (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y
diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y hélices
(espirilos). Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son móviles.
Hongos: Son
un reino de seres vivos unicelulares o pluricelulares que no forman tejidos
y cuyas células se agrupan formando un cuerpo filamentoso muy ramificado
Medio de cultivo: Consta
de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el
crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas.
Crecimiento: Es el aumento
continuo del tamaño en un organismo consecuencia de la proliferación
celular que conduce al
desarrollo de estructuras más especializadas del mismo.
Plántula: se denomina a cierta etapa del desarrollo del esporófito, que comienza cuando la semilla sale de sudormancia y germina, y termina cuando el esporofito desarrolla sus
primeras hojas nocotiledonares.
Zamia: Es un género de cicada de la familia Zamiaceae, con cerca de 50 especies. El género comprende arbustos deciduos con tallos aéreos o
subterráneos circulares, con frecuencia superficialmente.
Introduccion
|
Zamia ipetiensis
|
Reino: Plantae
Filo: Tracheophyta
Clase: Cycadopsida
Orden: Cycadales
Familia: Zamiaceae
Género: Zamia
Especie:
Zamia ipetiensis
|
Existe un grupo importante de hongos y
bacterias que presentan efectos antagónicos con otros microorganismos y esta
acción puede ser aprovechada como una forma de control biológico de patógenos
vegetales.
Entre los microorganismos más importantes se encuentran
las bacterias de los géneros Fusarium, Pseudomonas y Bacillus
y hongos de los géneros Gliocladium y Trichoderma. Sin embargo
durante este ensayo nos estaremos enfocando en hongos extraidos de la hoja de Zamia
ipetiensis y de los siguientes microorganismo patógenos tales como la Klebsiella
y la Proteus.
La Zamia ipetiensis es de
Panamá, en una región también habitada por el pueblo Ipetí, a la que está
llamado. Zamia ipetiensis tiene un tallo subterráneo que crece hasta 4 pulgadas
de diámetro, y deja crecer hasta 4-5 metros de largo. Estas hojas tienen una
sensación casi plástico a ellos.
Zamia ipetiensis está amenazada debido a que
su hábitat se compone de sólo dos pequeñas poblaciones en el medio silvestre, y
está siendo destruida por la agricultura.
En el
mundo biológico existe una interacción continua entre los patógenos potenciales
y sus antagonistas, de forma tal que estos últimos contribuyen a que en la
mayoría de los casos no se desarrollen la enfermedad. En condiciones naturales
los microorganismos están en un equilibrio dinámico en la superficie de las plantas.
Mecanismos de acción
Se han descrito varios
mecanismos de acción de los antagonistas para controlar el desarrollo de
patógenos. Algunos de estos son antibiosis, competencia por espacio o por
nutrimentos, interacciones directas con el patógeno (micoparasitismo y lisis
enzimática) e inducción de resistencia.
No es fácil
determinar con precisión los mecanismos que intervienen en las interacciones
entre los antagonistas y los patógenos en la planta. En general, los antagonistas
no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de éstos es una
característica importante para su selección como agentes de control biológico.
Si el antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo
de resistencia en el patógeno. Este riesgo de resistencia también se reduce mediante
el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo de acción.
Competencia
Esta constituye un mecanismo de acción
antagónica muy importante. Puede definirse como el comportamiento desigual de
dos o más organismos ante un mismo requerimiento, siempre y cuando la
utilización del mismo por uno de los organismos reduzca la cantidad disponible
para los demás. Un factor esencial para que exista competencia es la escasez o
limitación de un elemento porque si hay exceso no hay competencia.
Interacción directa
con el patógeno
Un tipo de
interacción directa entre los antagonistas y los patógenos es el parasitismo.
El parasitismo es
la acción de un microorganismo parasitando a otro y puede ser definido como una
simbiosis antagónica entre organismos. Este consiste en la utilización del
patógeno como alimento por su antagonismo. Generalmente, están implicadas
enzimas extracelulares tales como quitinosa, celulosa, b1, 3 - glucanasa y
proteasa, que rompen las estructuras de los hongos parasitados. Los ejemplos
más conocidos de hongos hiperparásitos son Trichoderma
y Gliocladium.
Ambos ejercen su
acción mediante varios mecanismos, entre los cuales tiene un rol importante el
parasitismo. Los hongos del género Trichoderma
han sido muy estudiados como antagonistas de patógenos de suelos como Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii y Sclerotium
cepivorum y existen varias formulaciones comerciales desarrolladas a partir
de ellos.
El efecto antagónico de las bacterias aisladas
puede evaluarse usando varios métodos, como los descritos a continuación:
a) Goteo de los
aislamientos. Se colocan 5 o 6 gotas alrededor del borde de una caja de Petri,
la cual se deja en incubación durante dos días a 15 °C. Un disco del hongo
evaluado, de una semana de crecimiento, se coloca en el centro de la caja y se
mide el halo de inhibición.
b) Depositar una
gota del cultivo bacteriano en una caja de Petri a una distancia de 10 cm del
micelio del hongo creciendo activamente en PDA. Se incuba por siete días y
después se examina la zona de inhibición.
c) Las cepas de Bacteriana se cultivan en un frasco de 500 ml durante siete
días en 100-200 ml de caldo de papa, el cual se agita constante; la solución
debe mantenerse en la oscuridad. Después se agregan 6 g de agar, se lleva a la
autoclave a 121 ° C por 20 min y se procede a verter en cajas de Petri. Una vez
que el medio se ha solidificado se colocan en las cajas de Petri discos de 0,7
cm de diámetro conteniendo el hongo a evaluar. La evaluación se basa en el porcentaje
de inhibición del hongo.
d) Las colonias de
bacterias antagonistas se siembran utilizando una aguja para este propósito,
dejando cuatro colonias por caja de Petri. Se incuban a 28°C durante dos días. Estas
se matan con vapores de cloroformo y se retira el crecimiento. Después se hace
la siembra del hongo evaluado, preferiblemente ya esporulado, utilizando una
aguja para este propósito.
Producción de bacterias antagonistas
El aspecto más importante
es decidir la fracción a producir, para lo cual es necesario determinar los
modos de acción de la especie. Esto permite definir la estrategia de producción
y aplicación. En el caso de las bacterias, su acción principal está dada por la
producción de metabolitos bioactivos con efecto antibiótico o lítico, por lo
cual deben obtenerse concentraciones altas en los caldos de cultivo de estos
organismos y posteriormente lograr su concentración y purificación.
También la producción de biomasa puede
resultar importante porque al aplicarse como inoculó al suelo, incrementan su
cantidad y logran mejor competencia e interacción con el patógeno. En ambos
casos, el método de producción más utilizado es la fermentación sumergida, proceso
que tiene posibilidades de ser escalado con gran eficacia. También pueden
utilizarse métodos más artesanales como el cultivo líquido está-tico, que
mediante un cuidadoso proceso con el medio de cultivo y los parámetros de
incubación adecuados se logra una producción eficiente.
La competencia por el espacio y los
nutrimentos es más favorable, principalmente para los hongos que se desarrollan
en la superficie de las hojas antes de efectuar la penetración, no actuando
sobre aquellos que penetran rápidamente.
Objetivos Específicos
- Observar y distinguir la presencia de antagonismo con los hongos obtenidos a partir de la hoja de Zamia ipetiensis contra bacterias de prueba; tales como la Klebsiella y la Proteus.
Materiales
Cultivos
frescos en agar
Perforados o pajillas estériles de aproximadamente 5 mm dia.
Alcohol 95 %
Marcadores de punta fina
Mechero Bunsen y Encendedor
Platos de Agar Tripticasa de soja (para las bacteria) y Agar Papa- Dextrosa (para los hongos)
15 platos totales - 25 ml de medio (Agar Tripticasa de soja)
7 platos totales – 10 ml de medio (Agar Papa- Dextrosa)
Asa Micológica
Perforados o pajillas estériles de aproximadamente 5 mm dia.
Alcohol 95 %
Marcadores de punta fina
Mechero Bunsen y Encendedor
Platos de Agar Tripticasa de soja (para las bacteria) y Agar Papa- Dextrosa (para los hongos)
15 platos totales - 25 ml de medio (Agar Tripticasa de soja)
7 platos totales – 10 ml de medio (Agar Papa- Dextrosa)
Asa Micológica
Metodología
o Utilizamos
los hongos tipo endófito de la Zamia ipetiensis para la prueba
de antagonismo; junto con bacterias patógenas; tales como la Klebsiella y
la Proteus.
o A
cada uno de estos hongos se les clasificó de acuerdo al tipo de plántula (adulta y joven) y nivel de crecimiento
(rápido, medio y lento). Se obtuvieron 21 hongos endófitos; tanto como plántula
adulta y plántula joven.
o Luego
a estos hongos se sembraron en un medio
Papa- Dextrosa- Agar, con un número total de 9 platos, en la que cada plato
contenía de 3 a 2 hongos.
o A
medida que transcurría el tiempo se observaba el crecimiento que tomaban los
hongos.
o Se
utilizaban los medios de Papa- Dextrosa –Agar
para la prueba de antagonismo, sin embargo a esta técnica se permitió
sembrar los hongos juntos con las bacterias en este medio. Para esto se
utilizaron perforadores de corchos estériles en la cual median aproximadamente
5 mm dia.
o Luego
de esto se tomaron los platos que contenían el medio de Papa-Dextrosa- Agar
para realizarse una pequeño agujero en el centro por medio de los perforadores
de corcho estériles, y a este agujero se les agregó pequeñas cantidades del
medio tripticasa de soja, en este medio nos sirvió sembrar la bacteria que
fue de prueba junto con los hongos
sembrados en el medio.
Datos y Resultados
Cuadro 1.
Clasificación y numero de platos con los hongos endófitos de la Z. ipentiensis de acuerdo a su tipo de plántula y crecimiento.
|
Tipo de
plántula
|
Tipo de
crecimiento
|
Numero
de Hongos
|
Numero
de platos
|
|
Plántula
Adulta
|
Rápido Crecimiento
|
9
|
3
|
|
Plántula
Joven
|
Rápido Crecimiento
|
2
|
1
|
|
Plántula
Adulta
|
Medio Crecimiento
|
4
|
2
|
|
Plántula
Joven
|
Medio Crecimiento
|
2
|
1
|
|
Plántula
Adulta
|
Lento Crecimiento
|
2
|
1
|
|
Plántula
Joven
|
Lento Crecimiento
|
1
|
1
|
Cuadro 2. Números de platos
sembrados con las bacterias
(Klebsiella y Proteus) y con los hongos extraídos de la Zamia ipertienses
|
Tipo de
Plántula
|
Tipo de
Crecimiento
|
Numero
de hongos
|
Numero
de plato con bacteria
|
Observaciones
(Se
Sembraron 2 hongos por cada plata que contenía la bacteria)
|
|
Plántula
Adulta
|
Rápido
crecimiento
|
9
|
4
|
Se
obtuvieron 3 platos con 2 hongo cada uno con la bacteria y 1 plato con 1 hongo y su bacteria
|
|
Plántula
Joven
|
Rápido
Crecimiento
|
2
|
1
|
Se
obtuvieron 1 plato con 2 hongos y con la bacteria
|
|
Plántula
Adulta
|
Medio Crecimiento
|
4
|
2
|
Se
obtuvieron 2 plato con 2 hongos cada
uno con la bacteria
|
|
Plántula
Joven
|
Medio
Crecimiento
|
2
|
1
|
Se
obtuvieron 1 plato con 2 hongos y la bacteria
|
|
Plántula
Adulta
|
Lento
Crecimiento
|
2
|
1
|
Se
obtuvieron 1 plato con 2 hongos y la bacteria
|
Las hifas son poco
resistentes al secado, por lo cual se trabaja en las formulaciones de las
formas reproductoras (conidios y clamidosporas) como polvos humedecedles, polvo
seco, 99 formulaciones en aceite y encapsulados que contienen el hongo terminado
mecanismo de biocontrol puede tener como consecuencia desde un efecto
biocontrolador específico hasta un amplio espectro de acción cuando se expresa
para controlar a más de un fitopatógeno. Estos análisis permiten explicar desde
el punto de vista molecular, la eficiencia y/o especificidad y/o amplio
espectro de algunos antagonistas fúngicos con relación a otros (Pérez et al.,
2001), y a partir de estos antecedentes seleccionar a aquel (aquellos) que sean
más apropiados.
Una de las evidencias que se debió demostrar
si nuestra técnica de antagonismo diera positiva o negativa, es por la
presencia de freno al crecimiento entre el hongo y la bacteria a prueba. Este
dicho freno se caracteriza como una línea que debe aparecer entre la bacteria y
hongo. Esta acción es un mecanismo particular que existes entre algunas
bacterias y algunos hongos. Sin embargo a nuestra prueba de antagonismo dio
como resultado negativa, debido a que no apreciamos la actividad entre el hongo
y la bacteria.
Conclusión
Hemos visto en vivo el comportamiento que
presentan las bacterias contra los hongos; cuando en estas se presenta en un
solo medio de cultivo como fuente de crecimiento y alimentación. En este
caso hemos apreciado este mecanismo con
los hongos extraídos de la hoja de Z.
ipetiensis en la que muestran
actividad antagónica con las bacterias
utlilizadas a diferentes pruebas,
en la cual mencionamos la Klesiella
sp. y la Proteus sp. Los hongos
antagonistas fueron más numerosos que los que se utilizaron con las bacterias, y cada aislado se puedo expresar uno o más hongos en forma simultánea frente a una de las
bacterias. De ahí que sea importante poder establecer cuántos y cuáles
mecanismos está expresando un hongo antagonista frente a una determinada
bacteria. Es relevante mencionar que las pruebas realizadas dieron negativas
debido a contaminaciones que hubo dentro del laboratorio.
Recomendaciones
1. Mantener
higiene dentro del laboratorio.
2. Presta
con mucha atención a todos los pasos que realizamos.
3. Ser
responsables en ver los crecimientos de los hongos entre otras cosas.
4. Mantener
higiene total con los materiales de trabajo del laboratorio.
Referencias Bibliográfica
-
scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010.
-
Fernández-Larrea, O. 1985. Microorganismos entomopatógenos y
antagonistas: posibilidades de producción. CIDINISAV. Boletín Técnico no. 1.
-
Fernández-Larrea, O. 1997. Procedimiento para la obtención de productos
líquidos concentrados estables por cuatro meses de Trichoderma harzianum. Cuba,OCPI. 8p.
